آزمون توليد سيدروفور با استفاده از روش پيشنهادي Pérez-Miranda و همکاران (2007) و بر اساس استفاده از محيط کشت پایه‌ای به نام کروم آزرول- اس (CAS)[1] صورت گرفت. هاله‌ی نارنجي اطراف کلنی‌ها نشان‌دهنده‌ی توان توليد سيدروفور بوده و ارزيابي توان توليد سيدروفور توسط باکتری‌ها از طريق محاسبه‌ی نسبت قطر هاله به قطر کلني (HD/CD)[2]، 120 ساعت پس از کشت انجام شد. روش آماده سازی این محیط کشت بشرح زیر می باشد.

 تهیه محيط CAS-Agar

براي آماده‌سازی اين محيط، چهار محلول زير به‌طور جداگانه تهيه، استريل و سپس باهم مخلوط می‌شوند:

1- محلول معرف رنگي: 10 میلی‌لیتر از محلول حاوي آهن (1 ميلي مول FeCl3.6H2O در 10 ميلي مول HCl) با 50 میلی‌لیتر از محلول CAS (21/1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر آب) به ‌آرامی مخلوط می‌شود. اين مخلوط به رنگ ارغواني تيره به آهستگي و در حال بهم زدن مداوم به 40 میلی‌لیتر از محلول[3]HDTM (82/1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر آب) اضافه می‌شود. محلول حاصل به رنگ آبي تيره به‌طور مجزا اتوکلاو و تا دماي حدوداً C°50 سرد می‌شود.

2- محلول بافر: براي تهيه اين محلول 24/30 گرم از بافر Pipes[4] در 750 میلی‌لیتر از يک محلول حاوي 3/0 گرم KH2PO4، 5/0 گرم NaCl و 1 گرم NH4Cl حل می‌شود. pH محيط با استفاده از محلول KOH در 8/6 تنظيم می‌گردد و حجم بافر با آب مقطر به 800 میلی‌لیتر رسانده شده و پس از افزودن 15 گرم آگار، در اتوکلاو استريل و تا دماي حدود C°50 سرد می‌گردد.

3- محلول غذايي: اين محلول حاوي 2 گرم گلوکز، 2 گرم مانيتول، 493 میلی‌گرم MgSO4.7H2O، 1/1 میلی‌گرم CaCl2، 17/1 میلی‌گرم MnSO4.H2O، 4/1 میلی‌گرم H3BO3، 04/0 میلی‌گرم CuSO4.5H2O، 2/1 میلی‌گرم ZnSO4.7H2O و 1 میلی‌گرم Na2MoO4.2H2O در 70 میلی‌لیتر آب است که پس از اتوکلاو به دماي C°50 رسانده می‌شود.

4- محلول کازآمينو اسيد: 30 میلی‌لیتر از محلول کازآمينواسيد (10 درصد) با عبور از صافي غشايي با قطر منافذ µ 45/0 استريل می‌گردد پس از آماده شدن محلول‌های فوق، محلول‌های غذايي 3 و 4 به محلول بافر 2 اضافه می شود و ضمن به هم زدن آرام و مداوم، محلول معرف رنگي (محلول 1) به‌آرامی به آن‌ها اضافه می‌گردد. مخلوط چهار محلول پس از يکنواخت شدن بر حسب نحوه‌ی کشت در ظروف پتري توزيع می‌گردد.

روش کشت باکتري روي محيط CAS-Agar

مایه‌زنی باکتری‌ها با استفاده از روش کشت مستقيم[5] صورت گرفت، به‌این‌ترتیب که محيط CAS-Agar به مقدار 25 میلی‌لیتر در ظروف پتري توزيع و پس از انجماد کامل هر ظرف پتري به چهار قسمت مساوي تقسيم و مرکز هر قسمت با 7 ميکروليتر از سوسپانسيون باکتري و با جمعيت تنظيم شده ( CFU/ml108×1) با روش قطره گذاري[6] مایه‌زنی گرديد. ظروف کشت شده پس از گرماگذاری به مدت 120 ساعت در دماي C°28 ازنظر توليد سيدروفور مورد ارزيابي قرار گرفتند (علیخانی 1382). 

لازم به ذکر است که بعلت کپی کردن متن از ورد اعداد اعشاری به صورت برعکس نوشته شده است، مثلا منظور از 21/1 میلی گرم بر کیلوگرم عدد 1 ممیز 21 میلی گرم بر کیلوگرم است.

[1] Chrome-Azurol S:CAS

[2] Halo Diameter/Colony Diameter

[3] Hexsa decyl tri methyl ammonium bromide:HDTMA

[4] Piperazin- 1, 4- bis (2- ethan sulfonsaure)

[5] Direct Plate Method

[6] Drop Plate Method